案例 | JMP客製實驗設計最佳化胃癌患者PBMC分離方案的研究

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胃癌是癌症死亡的常見原因，在我國的發病率居高不下，嚴重威脅人民健康(鄭瑩和吳春曉, 2016)。外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)與胃癌的生存預後密切相關(Tsai et al., 2013)，PBMC具有免疫功能(呂秋菊等, 2015)、具有顯著的臨床和生物學研究價值(Kim et al., 2016)，廣泛應用於腫瘤治療研究(Koeck et al., 2016)。但是自外周靜脈血分離PBMC的條件暫無統一意見(Moreli et al., 2016; Corkum et al., 2015; 代光明等, 2014)，亟待深入研究。

基於JMP軟體的實驗設計，在有效控製誤差的前提下，用較少的實驗次數，獲得可靠的結果，已被廣泛應用(吳繁等, 2016)。本研究採用JMP軟體的客製設計PBMC的分離條件，最佳化離心時間及速度，為胃癌患者PBMC的分離最佳化、基礎以及臨床研究提供依據。

材料與方法

本實驗用靜脈血採集自安徽醫科大學第一附屬醫院胃腸外科的胃癌患者。
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研究淋巴細胞分離液分離胃癌患者外周靜脈血PBMC的效率，觀察離心時間(X1)、離心速度(X2)對離心後PBMC分離層厚度(Y)的影響。綜合預實驗及文獻結果，確定離心時間的範圍為10~30min，離心速度的範圍為1000~3000r/min。PBMC分離層厚度作為反應變數，目標設置為最大化。模型中選擇二次交互作用及二次冪。定義因數約束：1X1+1X2≤3025，1X1+1X2≥1020，客製設計PBMC分離條件，X1、X2遇小數時四捨五入取整數，共12次實驗(下表)。

PBMC分離方法
含EDTA抗凝管採集患者外周靜脈血4ml，15ml離心管中距Ficoll液面1cm處沿管壁緩慢加血液至Ficoll液面上。20℃溫度下按照客製設計結果的參數進行離心，離心後從管底至液面分四層，依次為紅細胞和粒細胞層、分層液層、單個核細胞層、血漿層。

PBMC離心厚度測定
分離後的離心管用膠布固定於垂直牆面，固定數碼相機於PBMC雲霧層水準高度，調整焦距拍攝照片。照片置入Photoshop CS軟體，測量雲霧層厚度：同一試管圖片中100mm刻度的物理長度作為參照，尺規工具測量其圖元長度，資訊面板讀取資料並記錄，相同方法測量PBMC厚度(圖元長度)，按照以下公式計算PBMC雲霧層的物理長度(待測厚度)：

PBMC活力測定
根據JMP軟體分析得出最佳化條件，離心分離PBMC，移液管插入雲霧層，輕輕吸出雲霧層，置入新的離心管中，加入3倍PBMC體積的PBS，20℃，2000r，10min，洗滌兩次，棄上清。加500ul PBS稀釋，製備單細胞懸液。移液器吸取450ul上述懸液至EP管，加50ul台盼藍溶液，細胞懸液與0.4%台盼藍溶液9:1混合、混勻(終濃度0.04%)。3min內拍照，PS軟體手工標記、計數活細胞及死細胞。鏡下觀察，死細胞被染成藍色，活細胞拒染呈無色透明狀。計算細胞存活率：細胞存活率(%)=活細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數) X 100%。

JMP軟體對客製設計結果資料進行分析，採用標準最小平方法分析離心時間、離心速度的主效應、二次效應、交互作用，P＜0.05為差異具有統計學意義。

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結果與分析

PBMC的厚度測量結果
利用JMP客製設計得到12次實驗，根據每次實驗中的具體離心時間、離心速度參數，進行離心，離心後拍照，Photoshop軟體測量離心管中PBMC的厚度，結果見表1。

表1 不同離心條件下PBMC厚度測量結果

離心時間、離心速度對PBMC厚度的影響

利用JMP軟體擬合模型，採用標準最小平方法進行效應篩選，離心時間及速度兩個因素的主效應、二次效應、交互作用對PBMC厚度的影響(表2)。

表2 離心分離因素對PBMC厚度的影響

離心時間、離心速度及其交互作用對PBMC厚度的影響均具有統計學意義，P＜0.05；時間與速度的交互作用無統計學意義(P＞0.05)。對各參數估計值軟體排序(表3)，離心時間的影響大於離心速度。

表3 排序後的參數估計值

模型擬合情況

標準最小平方法擬合模型的變異數分析(表4)，模型和誤差的均方分別為0.191981、0.021543，F值為8.911，模型的P＜0.01，表明擬合模型在α=0.01的水準上是顯著的。

表4 客製實驗設計模型的變異數分析

該擬合模型中預測值與實際值的關係(圖1)可見：決定係數R2=0.88，表明該模型可以解釋88%的變異，模型擬合較好。

圖1 預測值與實際值的關係

曲面圖刻畫
根據標準最小平方法擬合模型，利用JMP軟體進行因數刻畫(曲面刻畫器)，將具有反應變數的模型顯示為曲面，得到曲面圖(圖2)。可以直觀地找到反應變數即PBMC厚度的最大值，並且可以觀察離心時間及離心速度之間的交互作用。

圖2 離心時間與速度交互影響PBMC厚度的曲面圖

預測刻畫器最優設置
JMP軟體預測刻畫器中選擇最大化意願，軟體自動調整預測刻畫圖形，得到PBMC厚度為最大值的最優設置(圖3)發現：密度梯度離心法分離胃癌患者外周血PBMC，獲取PBMC最大厚度的方法是：離心時間使用10min，離心速度定為2306.962r/min，約為2307r/min。本實驗預測，在上述條件下，PBMC厚度理論值為2.596923mm，95%CI(2.34213, 2.85171)。

圖3 預測刻畫器最大化意願的設置

最佳化條件下的細胞活力測定
離心時間=10min，離心速度=2307r/min，離心所得PBMC進行台盼藍染色(圖4)。細胞總數為199個，死細胞總數為8個，細胞存活率為95%。

圖4 PBMC台盼藍染色(×10)

討論
密度梯度離心被廣泛應用於PBMC的分離（趙傑等，2014），但不同單位、不同研究人員採用不同的離心時間、離心速度分離PBMC，分離效果文獻報告較少(Huang et al., 2014; Saidijam et al., 2014)，缺乏標準操作程式和指南，導致實驗結果缺乏一致性、可比性，部分離心分離效率較低，影響後續實驗地進行。

本研究使用JMP軟體進行客製設計，以PBMC離心厚度作為反應變數，離心時間、離心速度作為因數變數，獲取12次實驗，離心分離的PBMC厚度採用Photoshop CS6.0測量，經標準最小平方法分析發現：離心時間、離心速度的主效應及其二次效應均對PBMC厚度產生影響；離心時間與離心速度的交互作用無統計學意義。

建立模型的決定係數R2=0.88，可以解釋88%的反應變異。預測的PBMC厚度與實際值一致性較好。預測刻畫得到的最優分離條件：離心時間=10min，離心速度=2307r/min，預測的PBMC厚度=2.596923mm，95%CI(2.34213, 2.85171)，實際厚度=2.7mm，台盼藍染色發現細胞存活率=95%。

離心時間、離心速度的二次效應在實驗操作過程中不具有實際意義。本研究發現的最優條件與蔡敏敏等人的報告(蔡敏敏等,2016)不一致，主要原因有：

• 設計方案不同，蔡敏敏等僅僅採用分組實驗設計，本研究採用JMP軟體實施客製實驗設計，該設計方法基於數學模型，統計結果更具科學性、先進性(史智佳等, 2010)；
• 研究物件存在一定的差異；
• 其他實驗條件如溫度可能存在一定的差異；
• 實驗設備如離心機品牌差異。

預測刻畫器分析發現：離心時間、離心速度的主效應與反應變數PBMC厚度之間均呈現曲線關係，隨著離心時間的延長，PBMC厚度先降低、再升高，隨著離心速度的增加，PBMC厚度先增加、再減少，表明因數變數即離心時間和速度對PBMC厚度的影響是複雜的，並不是簡單的線性相關關係，值得在實驗過程中引起注意。

本研究利用因數刻畫器模擬計算的最佳離心時間、離心速度進行驗證，發現PBMC實際厚度落在預測厚度範圍內，表明模型擬合較好。台盼藍染色表明：最優條件下離心所得細胞的存活率較高，可以用於後續的實驗研究。本研究為胃癌患者外周血PBMC離心條件的最佳化研究提供了新的方法。

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