各実行にコストと時間がかかる場合の DoE (灌流バイオリアクターにおける低スループットプロセス最適化)

[#1]

こんにちは、

私は、灌流バイオリアクター (酵母を使用) 内のプロセス条件を最適化するための DoE を実行したいと考えています。使用しているシステムのスループットは基本的に 1 で、各実行には 1 ～ 2 週間かかります。これらの制約のため、実行を 1 回実行し、実行中に要因を変更することを考えていました。サンプリングして瞬間的な指標や毎日の容積収量を取得することで、応答 (製品の力価と細胞固有の生産性) を監視できます。実行中に変更するのは非常に簡単な溶存酸素 (DO)、温度、pH などの条件を最適化したいと考えていますが、培地組成などの他の要因は変更が瞬時に行われないため困難です。

このタイプの設計で遭遇する可能性がある問題は、あるステップでの細胞の状態の変化が、その後のステップに影響を与える可能性があることです。JMP を使用してこの種の実験を設計したことがある方、また、計画するのに最適な方法について何かヒントをお持ちの方はいらっしゃいませんか。あるいは、バイオリアクターでこのタイプの低スループット DoE を実行する方法について他のアイデアをお持ちの方がいらっしゃいましたら、新しいアイデアをお待ちしています。

助けてくれてありがとう！

[#2]

こんにちはベン2 、

あなたが説明した低スループットバイオリアクターの実験設定についてはよく知りませんが、役立つと思われる質問、コメント、提案がいくつかあります。

• あなたの目的は何ですか? システムの理解/調査および/または最適化ですか? 測定システムの精度はどの程度ですか? 実験の「ノイズ」はどの程度ですか?
  目的 (理解/最適化) に重点を置くかどうかに応じて、DoE アプローチ (どの要因が改善/応答に寄与するかを理解する) を使用するか、または主な目的がシステムの最適化である場合は、モデル駆動型の連続実験を使用するベイズ最適化アプローチを使用できます。ただし、実験システムの次元 (要因とレベルの数) と実験の「ノイズ」の程度によっては、モデルがシステムを最適化するための「方向」を判断するのに苦労する可能性があるため、ベイズ最適化はノイズの多いシステムや高次元のシステムに適さない場合があります。
  
  
• 実験中に因子レベルを変更する予定があり、順序の変更が結果に影響を与える可能性がある場合 (「あるステップでのセルの状態の変化が、その後のステップに影響を与える可能性がある」)、次の 2 つのオプションが考えられます。
  • ステップの順序を、分析に使用できるデータテーブル内の新しい制御されていない要素として保存しますが、時間傾向/変更順序に関する設計の堅牢性に関しては最適ではない可能性があります。時間傾向と要素の間に相関関係があり、2 つのうちどちらが応答の原因であるかを区別できない可能性があります。
  • 時間/順序を共変量として設計に含める (線形効果と二次効果の両方を含める) : これは、共変量を含む DoE の特殊なケース (「時間傾向ロバスト設計」) であり、Peter GOOS と Bradley JONES の「実験の最適設計: ケース スタディ アプローチ」(第 9 章) に記載されています。これらの議論に関する詳細情報:
    カスタムデザインにおける定義された順序での共変量
    DoEにタイムラグを組み込む
    
    
• また、因子の変更のしやすさに応じて (たとえば、「溶存酸素 (DO)、温度、pH は実行中に変更するのはかなり簡単ですが、培地組成などの他の因子は変更が瞬時に行われないため困難です」と述べています)、 分割プロット設計構造を使用することもできます。これにより、培地組成などの 1 つの全体プロット/「マクロ因子」を作成し、複数の試行を実行して応答を記録できます。このアイデアは、変更順序が共変量として考慮される複数の実験を実行する「マクロ因子」/全体プロットを使用した、時間傾向ロバスト設計の以前のアイデアに加えて使用できることに注意してください。

これらの質問、コメント、提案があなたにとって意味を持ち、役立つことを願っています。

[#3]

こんにちは、ビクター。

ご返信ありがとうございます。まずはご質問にお答えします。

1) 目的はシステム自体を最適化することではなく、私が発現している特定の組み換えタンパク質に対するシステムの条件を最適化することです。

2) システムの測定は、DO、pH、温度などの項目についてはフィードバックループによって制御されるため、かなり堅牢ですが、培地組成などは、細胞が栄養素を消費する方法に応じて時間の経過とともに変化します（培地は常に供給されています）。製品の反応は、人が物理的にサンプリングする必要があるため、より限定された測定です。

おそらく時間を共変量因子として使用すると思います。共変量因子として研究していない他のプロセス条件も含めることは理にかなっていますか? 実際には実験が 1 つしかなく、実験のさまざまなステップ (さまざまな要因) を使用して最適化しようとしていることを考えると、ベイズ最適化がどれほど関連性があるかはよくわかりません (ただし、間違っていたら教えてください)。分割プロット設計に関しては、実験が完了したら主に分析で行うことですか? 確認ですが、メディアを構成する個々のコンポーネントではなく、メディア全体を見ることをおっしゃっているのですか?

ご質問とご提案をありがとうございます。大変参考になりました。

[#4]

こんにちはベン2 、

はい、私の意見では、他のプロセス条件を共変量因子または非制御因子として使用することは理にかなっています（設計生成に含まれていなくても、これらの因子を使用した分析を可能にするため）。

ベイズ最適化についてはよくわかりませんが、因子を迅速に最適化するには、因子の変化（因子の変化/値だけでなく）の順序/時間依存性を考慮すると役立つかもしれません。

分割プロットとは、ランダム化が実験条件によって制約される状況であり ( ランダム化の制約がある設計を参照)、設計と分析の両方に反映されます。実験が 1 つしかない場合 (およびこの実験でのみ変化する要因がある場合)、この設定がどの程度適切であるかはわかりませんが、複数の実験を検討する場合は、分割プロット設計を構築できます。この場合、プロット全体は実行 (特定の酵母タイプまたは実行中に変更できない要因を含む) と見なされ、"変更しやすい" 要因 / サブプロットは実行中に変更できる共変量要因であり、順序 / 時間が考慮されます。

この回答が少しでも意味を成すといいのですが、

[#5]

こんにちはベン2 、

私はバイオリアクターの最適化の経験があります。直面する課題の 1 つは、バイオリアクターの撹拌、pH 制御、通気を途中で変更すると、バッチ全体にとって「最適な」条件を決定する際に混乱が生じることです。途中で条件を変更すると、細胞活動にさまざまなストレスが生じ、発酵の進行に長期的な影響を与える可能性があります。

考慮すべきことの 1 つは、最適な培地組成が小規模とバイオリアクター規模で同じであるという仮定のもと、培地の最適化のためにスケールダウン (つまりフラスコを振る) できるかどうかです。これにより、DoE アプローチを実行するための実験の幅と実験の可用性が得られます。次に、各実行が要因の組み合わせをテストする DoE 設定で、バイオリアクター設定 (撹拌、pH、通気) のみを制御することに移行できます。つまり、DO% を 24 時間で 40%、48 時間で 50% などに設定します。

ご質問があれば、これについてさらにコメントさせていただきます。

ありがとう、

ベン

[#6]

こんにちは、ベン。

ご返信ありがとうございます！

念のため、私が操作しているリアクターは、一定の培地供給と、一定の「使用済み」培地（発現用の分泌タンパク質を含む）の排出が行われる灌流リアクターです。リアクターと振とうフラスコの供給戦略が異なることが、バイオリアクター規模で検討したい理由の 1 つです。また、当社のバイオリアクターで得られる細胞密度は、振とうフラスコで達成できるものよりも大幅に高くなります。

私はこの意見に非常に賛成です (「途中で条件を変えると、細胞活動に異なるストレス要因が生じ、発酵の進行に長期的な影響を与える可能性があります。」)。しかし、独立した実験で最適化を実行するオプションはありません。私は、実際に「実行」(1 つの実験のステップ) のデータを収集する前に、細胞を定常状態にするための移行ステップを許可しようとしていました。これにより、負担をいくらか軽減できると思います。初期のステップが後のステップに与える影響を最小限に抑える方法について、他に提案があれば、ぜひお聞かせください。

非常に役立つフィードバックをいただき、改めて感謝いたします。

[#7]

こんにちはベン2 、

申し訳ありませんが、連続灌流であることを見逃していました。はい、酵母を定常状態に戻してから、各「安定化」後に条件を実行するのは良い考えです。考慮すべきことの 1 つは、各「実行」に要する時間の長さです。各反復を、設定された期間 (つまり 72 時間) 実行しますか、それとも設定された目標 (つまり、細胞密​​度 X、生成物量 Y) で実行しますか?

あなたのアイデアにさらに付け加えると、細胞が定常状態に戻ったときに細胞の寿命/ストレス状態を測定する方法を検討してみてください。各定常状態で「これは前回の実行と同じ健康状態です」と言うためにどのようなテストを実行できますか。それは、OD600 値、生死比、または特定の代謝物のテスト (HPLC や Flex モニターのようなものをテストできるほど幸運であれば) などです。これにより、この一連の細胞を継続するか、またはそれらを破棄して新しいクライオ/シードを使用して継続する方がよいかを決定できます。

ベイズ最適化は反復的なアプローチにとって間違いなく良い選択肢ですが、開始するにはスコープ設計のようなものを検討することもできます。

DO についておっしゃいましたが、これは制御すべき目標ですか、それとも攪拌と通気の制御速度に分割したほうがよいでしょうか。私は通常、DO を、制御するパラメータではなく、バイオリアクタの状態の変化に対する細胞の反応の産物と考えています (ただし、特定のレベル以上に保つように制御する生産段階の目標 DO 値は、制御されたパラメータであると主張することもできます)。

お役に立てれば幸いです!

ベン

[#8]

わあ、それは楽しそうですね！私はあなたのプロセスの SME ではないので、状況と制約を本当に理解するにはあなたと話し合う必要があります。しかし、ここに私の考えをいくつか示します。

1. 反復を計画します。1 つの実験ですべてを割り当てて最適化しようとしないでください。調査を効率的に継続するために必要な知識について考えます。昨日うまくいった優れたモデルを持っていてもあまり効果的ではありません。

2. ノイズ（将来的に制御したくない要因、技術がない、資金がない、または制御が不便であると考えられる要因）を特定するために十分な時間を費やします。次に、設計精度を犠牲にすることなく推論空間を最大化するためにどのような戦略を使用しますか（例：ブロッキング、繰り返し、分割プロット）。

3. 分割プロットを使用する機会があると思います (必ずしも従来の方法ではありません)。次の記事を読むことを強くお勧めします。

Box, GEP、Stephen Jones (1992)、「堅牢な製品実験のための分割プロット設計」、応用統計学ジャーナル、第19巻、第1号

これらは、連続したステップの状況では非常に効率的です。,

4. 複数の実験を設計します (JMP では簡単に実行できます)。各実験について、各実験で得られるもの (たとえば、どのような潜在的な知識が得られるか (設計とノイズの解決、直線性、再現性)) と必要なリソースを比較対照します。各実験のすべての可能な結果を​​予測し、そのいずれにも対処できるように準備します (たとえば、実験を実行してもパフォーマンス メトリックが変化しない場合や、パフォーマンス メトリックに大きな変動が生じるが、そのいずれも因子効果に割り当てできない場合など)。

5. 最後に、そして最も重要なことは、結果に関係なく、事前に最良の実験を知る人は誰もいないということです。実験のプロセスについて学んだことを振り返り、それらの経験を活用して次の実験をより良く設計してください。